Martyna Straszewska 16.docx

Martyna Straszewska                                                                                                      16.04.2013r.

Temat:Właściwości spektralne nukleotydów pirydynowych (NAD+,NADP+).Oznaczanie aktywności transmitazy alaninowej.

Nukleotydy pirydynowe, tj. dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD+) oraz jego forma ufosforylowana - fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP+) pełnią role koenzymów (nie są trwale połączone z białkami) większości dehydrogenaz, przenosząc jony wodorkowe. Częścią aktywną NAD+ lub NADP+ jest pierścień nikotyno amidowy. W czasie utleniania substratu zachodzi przyłączenie protonu i dwóch elektronów Gon wodorkowy) do pierścienia nikotynowego. Możliwości szerokiego zastosowania nukleotydów pirydynowych w analityce wynikają z ich specyficznych właściwości: l. Zredukowane formy koenzymów wykazują wysoka absorbancje przy A=340 nm; nie wykazują jej formy utlenione koenzymów. W wyniku redukcji następuje zanik aromatycznego charakteru pierścienia w amidzie kwasu nikotynowego, co pociąga za sobą zmiany w widmie absorpcyjnym dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego. Forma utleniona i zredukowana wykazuje silne pasmo absorpcyjne przy A=260 nm, zależne od pierścienia purynowego i pirymidynowego, natomiast ich postać zredukowana ma dodatkowe pasmo przy

A=340nm, z powodu powstania układu dihydropirydyny. Jeśli w czasie reakcji powstaje NAD(P)H +, to wzrasta absorbancja przy 340 nm. Zmianę te można mierzyć  spektrofotometrycznie, śledząc przejście NAD(P) w NAD(P)H +. Zmiany absorbancji w jednostce czasu będą miara szybkości reakcji, która w określonych warunkach jest proporcjonalna do stężenia enzymu. Jest to tzw. test optyczny Warburga, stosowany bardzo często do oznaczania aktywności dehydrogenaz, których koenzymem jest NAD+ lub NADP+. Używając odpowiedniego substratu można oznaczyć aktywność specyficznej dehydrogenazy na podstawie ilości zredukowanego koenzymu powstającego zgodnie z ogólna reakcja: AH2+ NAD(P)+----- dehydrogenaza----àA+ NAD(P)+H+.2. Zredukowane formy koenzymów są trwale w środowisku alkalicznym i wykazują wówczas intensywna fluorescencje "własna". Formy utlenione ulęgają w takich warunkach natychmiastowej destrukcji. Zredukowane koenzymy są nietrwale w środowisku kwaśnym, natomiast utlenione wykazują trwałość w niskim pH. Właściwości te dają możliwość "zniszczenia", po zakończeniu reakcji, nadmiaru koenzymu pozostawiając do pomiaru niezmieniona ilość trwalej w danych warunkach formy nukleotydu - zredukowanej w środowisku alkalicznym bądź utlenionej w środowisku kwaśnym. 3. Obie formy, zredukowana i utleniona, koenzymu powstałego w reakcji mogą być przekształcone w silnie fluoryzujące pochodne, dzięki czemu można go oznaczać w bardzo niskich stężeniach (10.9- lO-10M).Jest to szczególnie przydatne przy oznaczaniu stężeń metabolitów w małych próbach

tkanek lub w pojedynczych komórkach.

W pierwszym doświadczeniu wyznaczamy widmo absorpcyjne dla NAD+ i NADH + H+

1M-6220          1mM-6,220                                         A=c x E x l                       

A=0,1mmol/l x 6,220 x 1                                           c=E x l / A                                            

A=0,622 mmol/l

0,622 ---100%

0,250 ----x %

x=40,19 %

NadH.H+ wykazuje absorbancję przy 340nm,natomiast forma utleniona NAD+ nie wykazuje takiej absorbancji,

              W drugim doświadczeniu wykonujemy krzywą kalibracyjnej dla NADH+H+ metodą spektrofotometryczną. Z roztworu podstawowego (0,2 mM) NADH + H+, który zawierał 200 nmoli zredukowanego koenzymu w 1 ml, przygotowaliśmy 6 rozcieńczeń do końcowej objętości 2 ml. Rozcieńczone roztwory zawierały 20, 40, 60, 80, 100 i 150 nmoli NADH + H+ w 1 ml roztworu. Do rozcieńczania użyliśmy buforu fosforanowego o pH 9,0. Dokonaliśmy pomiarów absorbancji roztworów o rosnącym stężeniu NADH + H+ w 340 nm względem buforu używanego do rozcieńczeń.

W trzeciej części oznaczaliśmy aktywności aminotransferazy alaninowej. Grupa α-aminowa wielu aminokwasów jest przenoszona na α-ketoglutaran w reakcji, której mechanizm określany jest jako mechanizm podwójnego przeniesienia.Aminotransferaza alaninowa katalizuje przeniesienie grupy aminowej z alaniny na α-ketoglutaran, a produktami reakcji są pirogronian i glutaminian. Po związaniu alaniny do enzymu zostaje z niej usunięta grupa aminową, która jest przeniesiona na fosforan pirydoksalu, a z aminotransferazy uwalnia się  pirogronian. Drugi substrat, α-ketoglutaran, wiąże się do zmodyfikowanego enzymu i przyjmuje od niego grupę aminową, a następnie zostaje uwolniony jako produkt reakcji - glutaminian.

Odważyliśmy 1 g nasion grochu,następnie przenieśliśmy go do małego moździerza roztarliśmy, najpierw „na sucho”, a potem dodając 1 ml 100 mM buforu Tris-HCl o pH 8,0. Dobrze roztarty materiał przenieśliśmy do probówek Eppendorfa i wirowaliśmy 5 min przy 15 000 obr./min. Do oznaczeń używaliśmy klarownego nadsączu rozcieńczonego 5x buforem używanym do homogenizacji. Do kuwety kwarcowej napipetowaliśmy 500 μl 100 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0 zawierającego 20 mM α-ketoglutaran, następnie dodaliśmy 100 μl roztworu NADH + H+ , 100 μl dehydrogenazy mleczanowej i 100 μl ekstraktu tkankowego. Kuwetę...