METODY HODOWLI I IDENTYFIKACJI GRZYBÓW.
WYKRYWANIE I ILOŚCIOWE OZNACZANIE
W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH PLEŚNI I DROŻDŻY
1. Pleśnie – grzyby nitkowate:
- wytwarzają grzybnię (mycelium) złożoną z rozgałęzionych komórek (strzępek – hyphae); u grzybów niższych strzępki są jednokomórkowe, zwykle wielojądrowe, natomiast u grzybów wyższych są podzielone poprzecznymi przegrodami (septami), a każda oddzielna komórka ma jedno jądro
- typy grzybni:
+ powietrzna – rozwija się na powierzchni podłoża, często w formie puchu lub pleśni
+ substratowa (pożywkowa) – grzybnia wnikająca w podłoże
- dla większości optymalna temperatura mieści się w zakresie 18-22oC (mała odporność na podwyższoną temperaturę – giną >60-70oC; przeżywają tylko zarodniki), pH 5-6
- rosnąc powierzchniowo na podłożach mogą korzystać z dużych ilości tlenu " szybsze przyswajanie substancji odżywczych z podłoża.
2. Pleśnie w żywności:
- pleśnie wykorzystywane w produkcji żywności – niektóre gatunki grzybów są stosowane do produkcji enzymów proteolitycznych, amylolitycznych, celulolitycznych i innych, a także do produkcji kwasów organicznych (np. cytrynowego, glukonowego) i serów pleśniowych:
+ kwas cytrynowy – Aspergillus niger
+ enzymy – Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma i inne
+ żywność orientalna (sosy sojowe) – Aspergillus flavus-oryzae
+ sery pleśniowe – Penicillium roqueforti, P. camemberti.
- pleśnie niepożądane w żywności:
+ wzrost pleśni na produktach żywnościowych wywołuje niekorzystne zmiany (barwne naloty na powierzchni, mięknięcie, powstawanie śluzów, upłynnienie produktu)
+ rozwijają się na produktach suchych przechowywanych w wilgotnych warunkach oraz na produktach o bardzo dużym stężeniu cukru lub soli
+ w psuciu żywności biorą udział przedstawiciele różnych klas:
SLAJDY
3. Wykrywanie pleśni:
- preparat mikroskopowy – najczęściej przyżyciowy w kropli spłaszczonej
- hodowla:
+ podłoża płynne
+ agar z brzeczką (półprodukt stosowany przy produkcji piwa lub miodu pitnego)
+ agar ziemniaczany
+ podłoże Chapka (brak wzrostu Rhizopus)
+ cechy morfologiczne kolonii obserwuje się zwykle do 2-3 tygodni
- oznaczanie liczby pleśni:
+ metoda zalewowa – nanoszenie płynnego rozcieńczenia na płytkę, a następnie zalanie jej płynnym podłożem
+ oznaczenie liczby pleśni należy wykonać tylko z jednego rozcieńczenia, z którego wyrosło ≤100 kolonii.
4. Drożdże:
- ok. 1500 gatunków, z czego kilkanaście wykorzystuje się w procesach biotechnologicznych
- jednokomórkowce; rozmnażają się głównie przez pączkowanie
- optymalna temperatura wzrostu 20-30oC przy pH 5-6
- tlenowce; w warunkach beztlenowych przeprowadzają fermentację alkoholową, która polega na beztlenowym rozkładzie cukrów prostych oraz niektórych dwu- i trójcukrów na alkohol etylowy i CO2:
C6H12O6 " 2CH3CH2OH + 2CO2 + 117 kJ (28 kcal)
- specyficzny składnik cytoplazmy – wolutyna (ziarnistości metachromatyczne, zapasowe źródło fosforanów; gromadzą się w komórkach podczas fermentacji, często brakuje ich w szybko rozmnażających się drożdżach
- w środowisku zasobnym w cukier mogą gromadzić glikogen (zużywany po wyczerpaniu węglowodanów
- wytwarzają także tłuszcze
- podział:
+ drożdże szlachetne – stosowane w przemyśle fermentacyjnym:
- piekarskie – Saccharomyces cerevisiae
- paszowe – S. cerevisiae, Candida utilis, C. tropicalis, C. plucherrima, Rhodotorula
- gorzelnicze – S. cerevisiae
- winiarskie – S. cerevisiae, S. ellipsoideus
- browarnicze – S. cerevisiae, S. carlsbergensis
+ drożdże dzikie – szkodniki w przemyśle fermentacyjnym i przetwórstwie żywności; zanieczyszczenia:
- przemysł winiarski:
+ najczęściej drożdże są oporne na wysokie stężenia SO2 (używany często do konserwacji moszczów owocowych – sulfitacja moszczów)
+ przy dostępie tlenu rozwijają się Candida spp. i Pichia spp., które przeprowadzają przemianę etanol " kwas octowy " ester etylooctowy (zjełczały zapach wina)
+ mogą być przyczyną śluzowacenia i drożdżowego posmaku win
+ Pichia spp. i Kloeckera spp. biorą udział w przemianach związków siarki w winach, co w obecności etanolu sprzyja tworzeniu merkaptanów (nadają winom ostry, nieprzyjemny zapach)
- browarnictwo:
+ Torulopsis, Pichia, Hansenula, Candida, Saccharomyces, Kloeckera
+ jedna z przyczyn mętnienia i drożdżowego posmaku piwa
+ zakażenie ograniczone dużym stężeniem alkoholu etylowego
+ w zacierach fermentacyjnych spotyka się głównie C. mycoderma (ma zdolność rozkładu etanolu do CO2 i H2O " zmniejszenie stężenia alkoholu w piwie)
- przemysł piekarniczy – C. mycoderma (walka z nimi jest trudna, gdyż przyrost ich masy w trakcie produkcji następuje równocześnie z rozwojem drożdży piekarniczych; powodują obniżenie siły pędnej drożdży piekarniczych)
- drożdże killerowe – produkują toksyny białkowe lub glikoproteinowe, które zabijają wrażliwe komórki drożdży tego samego lub innego gatunku
- drożdże osmofilne:
+ zdolność do wzrostu przy dużych stężeniach glukozy (60%)
+ rozwijają się na produktach o niskiej Aw (aktywność wody; minimum wody niezbędne dla rozwoju drobnoustrojów – czysta chemicznie woda ma wartość Aw = 1)
+ powodują psucie miodu, dżemu, syropów owocowych, soków
+ rozwijają się w marynatach i solankach (np. S. rouxi, S. mellis)
- inne drożdże niepożądane w żywności:
+ na osłonkach wędlin przechowywanych w lodówce – kredowe naloty
+ drożdże kożuchujące – psucie kiszonek
+ gatunki o właściwościach lipolitycznych – plamy na maśle i margarynie.
5. Wykrywanie drożdży:
- badanie mikroskopowe:
+ preparat bezpośredni – jeżeli badany materiał jest suchy (np. nalot na wędlinie) przed wykonaniem preparatu należy go rozetrzeć w 0,9% NaCl
+ preparat pośredni – np. połączony z barwieniem metodą Grama (drożdże są Gram(+))
+ preparat przyżyciowy niezabarwiony – najczęściej
+ barwienie przyżyciowe – oznaczenie żywotności ,wykrywanie substancji zapasowych
+ podłoże płynne
+ agar z brzeczką
+ specjalne podłoża ubogie w składniki odżywcze (np. McClavy).
6. Ocena właściwości drożdży:
- ocena żywotności drożdży:
+ oznaczanie % zawartości martwych komórek:
X = b · 100 / (a+b)
+ normy w drożdżach piekarskich:
- drożdże prasowane ≤5% martwych komórek
- drożdże suszone ≤25% martwych komórek
- badanie na obecność glikogenu:
+ z wykorzystaniem płynu Lugola
+ czerwonobrunatne ziarnistości glikogenu widoczne na tle jasnożółtej cytoplazmy
- badanie na obecność tłuszczu – zabarwienie komórek roztworem Sudanu " krople tłuszczu barwią się na granatowo.
7. Cechy morfologiczne i fizjologiczne ważne w identyfikacji drożdży:
- kształt komórek – 6 podstawowych kształtów, często charakterystycznych dla poszczególnych rodzajów (kulisty, elipsoidalny, cytrynkowaty, butelkowaty, cylindryczny, nitkowaty)
- wielkość komórek – pomiar minimum 20 komórek; zwykle 1-8 μm długości i 1-6 μm szerokości
- zdolność do tworzenia:
+ pseudogrzybni (pseudomycelium) – nitkowate struktury, często rozgałęziające się, złożone wyłącznie z komórek pączkujących lub pojedyncza, nitkowata komórka, mogąca rozgałęziać się, nieposiadająca przegród poprzecznych
+ grzybni
- zdolność do wytwarzania zarodników:
+ następuje w warunkach głodowych populacji i jest sposobem na przerwanie niekorzystnych warunków środowiska
+ najlepiej tworzą się przy małej ilości węglowodanów w podłożu oraz przy dobrym dostępie tlenu
- fermentacja cukrów – posiew na podłoże z dodatkiem 2% badanego cukru
- wykorzystanie azotanu jako źródła azotu – posiew na podłoże zawierające witaminy, ale bez innych źródeł azotu
- wykorzystanie etanolu jako źródła węgla – posiew na podłoże z dodatkiem etanolu
- rozkład tłuszczów.
oliwc12