Inhibicjaenzymatycznapdzik.pdf

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Inhibicja enzymatyczna

Każdą substancję, która zmniejsza szybkość reakcji katalizowanej przez enzym można

uważać za inhibitor. Hamowanie aktywności enzymów jest jednym z głównych sposobów

regulacji metabolizmu komórki i jedną z najważniejszych procedur diagnostycznych

stosowanych przez enzymologów. Analiza inhibicji enzymatycznej daje sugestie co do

specyficzności enzymów, budowy centrum aktywnego enzymu i kinetyki reakcji. W życiu

codziennym inhibitory enzymów spotykamy w postaci leków, antybiotyków, środków

konserwujących, toksyn i trucizn. Inhibitory działają na różne sposoby, poniżej omówimy

najprostsze przykłady mechanizmów inhibicji.

Inhibicja kompetycyjna

Inhibitor kompetycyjny (współzawodniczy) to substancja, która łączy się z wolnym

enzymem w sposób, który nie pozwala na związanie substratu przez cząsteczkę enzymu.

Oznacza to, że inhibitor i substrat wyłączają się wzajemnie, najczęściej z powodu

współzawodnictwa o to samo miejsce w cząsteczce enzymu. Inhibitor kompetycyjny może

być niemetabolizowalnym analogiem lub pochodną substratu, alternatywnym substratem lub

produktem reakcji. Klasycznym przykładem inhibitora współzawodniczego jest kwas

malonowy, który hamuje aktywność dehydrogenazy bursztynianowej (oksydoreduktaza

występująca w cykl Krebsa). Ponieważ kwas malonowy ma tylko jedną grupę metylenową to

nie może ulec reakcji utlenienia jak bursztynian. Może tylko połączyć się z enzymem w

kompleks EI , a kompleks może zdysocjować do wolnych E i I . Innym klasycznym

przykładem tego rodzaju inhibicji jest hamowanie przez amid kwasu sulfanilowego

biosyntezy kwasu foliowego z jego prekursora kwasu p -aminobezoesowego.

Istnieją przykłady inhibicji „współzawodniczej” powodowanej przez związki niepodobne

strukturalnie do substratów, jest to inhibicja zwrotna. Inhibitor (efektor, modulator, regulator)

łączy się z enzymem w miejscu innym niż centrum (miejsce aktywne). To połączenie

indukuje zmiany konformacji enzymu (w trzecio- lub czwartorzędowej jego strukturze) co

zniekształca miejsce wiązania substratu, a zatem uniemożliwia jego wiązanie.

Heksokinaza katalizuje powstawanie glukozo-6-fosforanu z glukozy i ATP. Hamowanie

tej reakcji przez fruktozę lub mannozę jest przykładem inhibicji kompetycyjnej przez

substraty alternatywne. Glukoza, fruktoza i mannoza są wszystkie substratami heksokinazy i

mogą przyłączać się do tego samego centrum aktywnego i być przemieniane w produkt

(heksozo-6-fosforan). W rezultacie fosforylacja każdej z tych heksoz jest hamowana przez

każdą z pozostałych dwóch.

Równanie na szybkość reakcji w obecności inhibitora kompetycyjnego na podstawie

założenia szybkiej równowagi ma postać przedstawioną poniżej:

Taką samą postać równania otrzymamy na podstawie założenia stanu stacjonarnego, tylko że

K m zastąpi K s .

Równanie na szybkości reakcji w obecności inhibitora kompetycyjnego w formie

odwrotnościowej (wykres Lineweavera-Burka) wygląda następująco (K m w miejscu K s ):

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Z postaci równania widać, że nachylenie wykresu zwiększa się o współczynnik [1+([I]/ K i )],

który powiększa wartość K m , ale przecięcie na osi 1/v pozostaje 1/V max .

Segal IH (1976)

Ta prawidłowość jest widoczna na powyższym wykresie. Każdemu stężeniu inhibitora

odpowiada inna prosta. W miarę jak rośnie stężenie inhibitora, przecięcie z osią 1/[S]

przesuwa się w stronę początku układu współrzędnych co znaczy, że K m app stale wzrasta.

Stałą inhibicji K i można obliczyć albo z nachylenia wykresu albo z przecięcia z osią 1/[S].

Gdy 1/v = 0, to przecięcie z osią 1/[S] wynosi –1/K m app , gdzie K m app = K m (1+ [I]/K i ).

Nachylenie wykresu w obecności inhibitora kompetycyjnego wynosi: nachylenie 1/S = K m /V max

[1+ ([I]/K i )].

Inhibicja niekompetycyjna

Spośród przykładów tego typu inhibitorów warto zwrócić uwagę na kwas

acetylosalicylowy (aspiryna). Kwas acetylosalicylowy hamuje niekompetycyjnie

dehydrogenazę 2-oksoglutaranową (kompleks enzymatyczny działający w cyklu Krebsa),

natomiast kwas salicylowy hamuje ten enzym kompetycyjnie. Wpływ obydwu tych związków

badano na oddychanie mitochondriów serca, poszukując przyczyn ochronnego działania

aspiryny na układ sercowo-naczyniowy. Innym przykładem inhibicji niekompetycyjnej jest

hamowanie aktywności niektórych izoform c yklazy a denylowej (AC5 i AC6) przez jony

wapnia w stężeniach mniejszych od 1 µM. Substratem cyklazy adenylowej jest ATP, a

produktem obok pirofosforanu jest cykliczny AMP, wtórny przekaźnik sygnałów w

komórkach. Wspomniane izoformy występują w sercu i naczyniach krwionośnych i uważa się

je za regulatory rytmu serca.

Klasyczny inhibitor niekompetycyjny nie ma wpływu na wiązanie substratu, zaś wiązanie

substratu nie ma wpływu na wiązanie inhibitora. Substrat i inhibitor wiążą się odwracalnie,

losowo i niezależnie, w różnych miejscach. Powstały kompleks jest katalitycznie nieaktywny.

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Klasyczną inhibicję niekompetycyjną można opisać tylko w warunkach szybkiej równowagi.

Wówczas K m = K S .

jest pozorną V max przy danym [I].

Ze wzoru widać, że skutkiem działania inhibitora niekompetycyjnego jest obniżenie V max . W

warunkach kinetyki stanu stacjonarnego gdy K m ≠ K S , równanie na szybkość maksymalną

reakcji zawierałoby składniki występujące w potęgach. konsekwencji czego wykres

odwrotnościowy (stosowany do wyznaczenia typu inhibicji) byłby nieliniowy.

Równanie odwrotnościowe przedstawia się następująco:

Z postaci równania widać, że zarówno nachylenie jak i przecięcie z osią 1/v na wykresie

odwrotnościowym są zwiększone o współczynnik (1+[I]/ K i ) w porównaniu do wykresu

„kontrolnego”. Jeśli nachylenie jak i przecięcie z osią 1/v zwiększają się o ten sam

współczynnik to przecięcie z osią 1/[S] pozostanie niezmienione, równe –1/K m .

Segal IH (1976)

Dla każdego stężenia inhibitora można wykreślić nową prostą. W miarę jak rośnie [I]

zwiększa się nachylenie kolejnych prostych, a także punkt przecięcia z osią 1/v. Zatem, wraz

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

ze wzrostem stężenia inhibitora V max i stale obniża się. K i można obliczyć z nachylenia albo z

przecięcia z osią 1/v.

Inhibicja akompetycyjna

Jako przykład inhibitora akompetycyjnego można wymienić lit, który jest stosowany w

leczeniu depresji maniakalnej. Lit hamuje monofosfatazę inozytolową, która katalizuje

hydrolizę fosforanu inozytolu. Hamowanie rozkładu monofosforanu inozytolu powoduje

wzrost jego stężenia w komórce kosztem wolnego inozytolu, potrzebnego do resyntezy

fosfatydyloinozytolu, pierwszego związku kaskady fosfoinozytolowej. Uważa się, że

nadmierna aktywność kaskady fosfoinozytolowej jest istotną przyczyną depresji maniakalnej.

Inny inhibitor akompetycyjny, kwas mykofenolowy hamuje reakcję katalizowaną przez

dehydrogenazę inozynomonofosforanu, co powoduje zmniejszenie puli nukleotydów

guaninowych i niewielkie podniesienie poziomu nukleotydów adeninowych. W rezultacie

takiej nierównowagi w dostarczaniu składników do syntezy kwasów nukleinowych, cykl

komórkowy zostaje zahamowany. Kwas mykofenolowy jest lekiem cytostatycznym i

immunosupresyjnym.

Kwas mykofenolowy

Klasyczny inhibitor akompetycyjny to taki, który wiąże się odwracalnie do kompleksu

enzym-substrat tworząc nieaktywny kompleks ESI. Inhibitor nie wiąże się do wolnego

enzymu. Ten sposób inhibicji jest rzadko spotykany w reakcjach jednosubstratowych. Warto

o nim wspomnieć, bo jest prostym przykładem sekwencyjnego dodawania dwóch ligandów w

ustalonym porządku. Akompetycyjna inhibicja jest powszechna w reakcjach

wielosubstratowych z powodu wspomnianego wyżej.

Zarówno kinetyka szybkiej równowagi jak i stanu stacjonarnego dają takie samo równanie

szybkości reakcji, więc K S może być zastąpione przez K m .

Równanie szybkości reakcji w obecności inhibitora kompetycyjnego wygląda następująco:

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Innymi słowy inhibitor akompetycyjny obniża V max i K m o ten sam współczynnik. Równanie

odwrotnościowe szybkości reakcji hamowanej inhibitorem akompetycyjnym wygląda tak jak

poniżej:

Nachylenie wykresu wynosi K m / V max , ale punkt przecięcia z osią 1/v jest podniesiony o

współczynnik (1+[I]/ K i ). W rezultacie krzywe „plus inhibitor” i „kontrolna” są równoległe.

W miarę jak rośnie [I], przecięcie z osią 1/v podnosi się dając serię równoległych prostych.

Segal IH (1976)

Inhibicja mieszana

Jest formą inhibicji niekompetycyjnej. Taką inhibicję obserwuje się w przypadku

hamowania przez jony kadmu arginazy z nerek i wątroby szczura (inhibicja mieszana

niekompetycyjna), czy hamowania syntazy tymidylanowej przez analogi

metylenotetrahydrofolianu. Proste na wykresie odwrotnościowym przecinają się po lewej

stronie osi 1/v, a nie jak w przypadku inhibicji niekompetycyjnej na osi 1/v.

Odczynniki i materiały

0,04 M bufor octanowy pH 4,7

0,2 M (200 mM) roztwór sacharozy w 0,04 M buforze octanowym pH 4,7

0,1 M (100mM) roztwór CuSO 4

1,0 % kwas 3,5-dinitrosalicylowy

Odpowiednio rozcieńczona inwertaza o aktywności dającej w reakcji z kwasem 3,5-

dinitrosalicylowym po 10 min inkubacji z 50 mM sacharozą absorbancję 0,4 – 0,6.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: