CHROMATOGRAFIA SITOWA (żelowa, sączenie molekularne) - podstawę podziału stanowią różnice w rozmiarach cząsteczek – rozdział zachodzi na skutek różnicy mas cząsteczkowych rozdzielanych związków. Chromatografia żelowa stosowana jest do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową lub do oddzielania białek od składników niskocząsteczkowych np. sole (odsalanie) lub związki używane do znakowania białek np. J125, fluoresceina. Kolumnę chromatograficzną wypełnia się złożem w postaci ziarenek o średnicy około 0,1 mm o zdefiniowanej wielkości porów zbudowanych z nierozpuszczalnego polimeru (typu: dekstran, agaroza) lub poliakrylamidu.
Sita molekularne
1. Sephadex – na bazie dekstranu
2. Sepharose - granulowana forma agaru
3. Sephacryl – całkowicie syntetyczne sito molekularne
Teoria filtracji żelowej
Ø cząsteczki o określonych rozmiarach dyfundują w głąb ziaren żelu tylko na określoną głębokość
Ø większe cząsteczki są eluowane wcześniej niż mniejsze
Ø faza nieruchoma = rozpuszczalnik zalegający wnętrze ziaren żelu
Ø faza ruchoma = rozpuszczalnik przemieszczający się pomiędzy ziarnami żelu
Po nałożeniu na żel mieszaniny, białka o małych rozmiarach wnikają do wnętrza ziaren duże natomiast nie mogą. Droga do momentu wycieku z kolumny, którą musi pokonać każdy ze składników próbki jest więc nierówna. Cząsteczki o najmniejszym ciężarze cząsteczkowym mają do pokonania najdłuższą drogę i dlatego wypływają najpóźniej z kolumny. Białka o dużej masie cząsteczkowej i o efektywnej średnicy większej niż pory ziaren złoża mają do pokonania krótszą drogę w żelu i wędrują najszybciej. Pojawiają się zatem jako pierwsze u wylotu kolumny.
Warunki rozdziału Do filtracji żelowej najczęściej stosuje się kolumny o długości 50-90 cm, wraz ze wzrostem długości kolumny zmniejsza się szybkość rozdziału białek. Objętość nakładanej próby nie powinna przekraczać 5% całkowitej objętości kolumny.Skład buforu elucyjnego nie wpływa bezpośrednio na rozdział białek, ale w celu zmniejszenia oddziaływań jonowych pomiędzy złożem a rozdzielanymi związkami nie stosuje się buforów o sile jonowej słabszej niż 0,02M.
Podstawy teoretyczne - parametry retencyjne
Całkowity czas retencji (tR) = czas liczony od momentu wprowadzenia próbki do momentu pojawienia się na chromatogramie maksimum piku (momentu pojawienia się na wyjściu z kolumny maksymalnego stężenia wymywanego związku)
Całkowita objętość retencji (VR) = objętość fazy ruchomej potrzebna do wymycia składnika, mierzona od momentu wprowadzenia próbki do momentu pojawienia się na chromatogramie maksimum piku:
VR = F0 ∙ tR
F0 – prędkość wypływu fazy ruchomej z kolumny (cm3/min)
Zerowy czas retencji (tM) = czas przebywania w kolumnie substancji, która nie oddziałuje z fazą stacjonarną (np. He w chromatografii gazowej)
Zerowa objętość retencji (VM):
VM = F0 ∙ tM
Zredukowany czas retencji (t’R) = różnica między całkowitym i zerowym czasem retencji
t’R = tR – tM
Zredukowana objętość retencji (V’R):
V’R = VR - VM
Zredukowany czas retencji i zredukowana objętość retencji charakteryzują zatrzymywanie się próbki na fazie stacjonarnej i są wielkościami charakterystycznymi dla danej substancji.
Względny czas retencji:
ri,w = t’Ri / t’Rw
„i” – dowolna substancja
„w” – substancja wzorcowa
Współczynnik retencji (k):
k = (tR – tM) / tM
lub
liczba moli X w fazie stacjonarnej nS cSVS
k = = =
liczba moli X w fazie ruchomej nm cmVm
cS, cm – stężenie składnika X w fazie ruchomej i stacjonarnej
VS, Vm – objętość fazy ruchomej i stacjonarnej
zawartość substancji w fazie nieruchomej
Rf =
zawartość substancji w fazie ruchomej
Równowaga podziału ma charakter dynamiczny – cząsteczki przemieszczają się pomiędzy fazami.
1
1+k
Rf – współczynnik przepływu/współczynnik prędkości/współczynnik zatrzymania
Ułamek zawartości substancji w fazie nieruchomej wynosi:
k
= 1 – Rf
k + 1
W chromatografii planarnej stosuje się współczynnik RM
1 - Rf
RM = log = log k
Rf
Współczynnik selektywności a - wpływa na oddalanie pików
tRB – tM kB
a = =
tRA – tM kA
tRA, tRA - czasy retencji substancji A i B
kA, kB – współczynniki retencji substancji A i B
Sprawność kolumny
v zdolność kolumny do wytwarzania wąskich pików
v wyznacza się liczbą półek teoretycznych (N), która zależy od liczby równowag wzdłuż kolumny
Półka teoretyczna = objętość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniami substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i nieruchomej.
Kolumna chromatograficzna składa się z N półek toretycznych:
L = N ∙ H
L – długość kolumny; H- wysokość równoważna półce teoretycznej; N – liczba półek
Po wprowadzeniu substancji na „pierwszą półkę” kolumny ulega ona podziałowi między fazę ruchomą i stacjonarną, zgodnie z wartością współczynnika podziału K.
Zdolność rozdzielcza kolumny (RS)
tR2 - tR1
RS = 2 ∙
w1 + w2
tR2, tR1 - czasy retencji substancji 1,2
w1,w2 – szerokości pików mierzone przy podstawie
RS – zależy od:
v selektywności wyrażanej współczynnikiem selektywności a
v sprawności kolumny – liczby półek teoretycznych N
v retencji wyrażonej ułamkiem zawartości substancji w fazie nieruchomej
que-hiciste