Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia jest wykazanie właściwości amfoterycznych α-amino-kwasów poprzez miareczkowanie wodnego roztworu glicyny roztworami mocnego kwasu (HCl) i mocnej zasady (NaOH).
Białka stanowią istotny składnik każdej żywej komórki. Cząsteczki białek zbudowane są z 20 różnych aminokwasów. Z uwagi na fakt, że właściwości chemiczne aminokwasów rzutują na charakter białek, wydaje się słuszne bardziej szczegółowe omówienie właściwości aminokwasów ze szczególnym uwzględnieniem ich charakteru amfoterycznego.
Cząsteczki aminokwasów mają dwie grupy funkcyjne: grupę aminową –NH2 i karbosylową –COOH.
W tych aminokwasach, które wchodzą w skład białek, grupa aminowa znajduje się zawsze przy węglu α w stosunku do grupy karboksylowej.
Wzór ogólny aminokwasu
Ponadto aminokwasy wykazują czynność optyczną ze względu na obecność asymetrycznego atomu węgla α (który posiada cztery różne podstawniki z wyjątkiem glicyny, w której R=H). Rozróżnia się dwa szeregi aminokwasów: L i D; cząsteczki szeregu L i D mają się do siebie jak przedmiot do swojego odbicia lustrzanego (cząsteczki szeregu L i D nie dają się na siebie nałożyć).
COOH
C
NH2
H
R
L-aminokwas D-aminokwas
Symbole D i L oznaczają bezwzględną konfigurację podstawników na asymetrycznym atomie węgla.
Zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego liniowo przez związki optycznie czynne przyjęto oznaczać odpowiednio symbolami D (w prawo) i L (w lewo).
Na szczególna uwagę zasługują właściwości chemiczne aminokwasów wynikające z obecności w cząsteczce dwóch grup funkcyjnych: kwasowej grupy karboksylowej (-COOH) i zasadowej grupy aminowej (-NH2). W roztworach wodnych aminokwasy występują głównie w postaci jonu obojnaczego:
jon obojnaczy
Jeżeli taki jon obojnaczy (dwubiegunowy) znajdzie się w środowisku zasadowym, to wykazuje właściwości kwasowe:
Natomiast, jeżeli znajdzie się w środowisku kwasowym to wykazuje charakter zasadowy:
Istnieje, więc takie, pH roztworu, przy którym cząsteczki aminokwasów występują w formie jonu obojnaczego, którego sumaryczny ładunek elektryczny jest równy zero. Taka wartość pH nosi nazwę punktu izoelektrycznego (pI) – pHi. Ze względów praktycznych wprowadzono pojęcie pK = -log K, gdzie K oznacza stałą dysocjacji grupy kwasowej lub zasadowej. Zależność miedzy pH i pK wyraża równanie Hasselbacha-Hendersona, które dla aminokwasów może przybierać następujące formy:
1. w środowisku kwasowym:
2. w środowisku zasadowym
gdzie K1= stała dysocjacji grupy –COO-, K2= stała dysocjacji grupy –NH3+
Z równań tych wynika, że w przypadku równych stężeń jonów obojnaczych i cząsteczek aminokwasu obdarzonego ładunkiem (formy kationowej lub anionowej), wartości pK i pH są równe. Z równań 1 i 2 wynika dalej wzór na podstawie którego możemy wyliczyć wartość pH w punkcie izoelektrycznym pHi:
2
Charakter amfoteryczny aminokwasów ujmuje graficznie krzywa miareczkowania wodnych roztworów aminokwasów mocnymi kwasami i zasadami (ryc. 1). Przedstawia ona zależność wartości pH miareczkowanego roztworu aminokwasu od ilości dodanych gramorównoważników kwasu lub zasady.
Miareczkowanie roztworu aminokwasu z równoczesnym pomiarem pH roztworu pozwala na doświadczalne wyznaczenie krzywej dysocjacji aminokwasu i wartości pK jego grup funkcyjnych.
Zależnie od liczby ulegających jonizacji grup funkcyjnych w cząsteczce aminokwasu, krzywe miareczkowania będą miały charakter dwufazowy lub trójfazowy.
Zachowanie się wodnego roztworu glicyny pod wpływem dodawania roztworu kwasu lub zasady.
Wartość pH wodnego roztworu glicyny wynosi 6. Wprowadzenie do roztworu glicyny roztworu HCl powoduje początkowo szybkie zmniejszenie się wartości liczbowych pH już po dodaniu małych ilości kwasu. Obojnacze jony glicyny zachowują się jak zasada przyłączając jony wodorowe H+:
jon obojnaczy /A+-/ kation o charakterze
słabo kwasowym /A+/
Przy ilości gramorównoważników kwasu dodawanego do roztworu glicyny równej ilości moli glicyny obecnych w roztworze stężenia jonów obojnaczych A+- i kationów A+ są równe i zgodne z równaniem:
pH = pK1 = 2,4
W tym punkcie krzywa miareczkowania wykazuje przegięcie, a roztwór w zakresie pH 1,8 – 3 wykazuje największe właściwości buforowe.
Analogicznie przebieg ma krzywa miareczkowania glicyny roztworem NaOH.
Pod wpływem zasady amfoteryczne jony obojnacze glicyny reagują jak słaby kwas z jonami OH-.
NH3+
+ H2O
+ OH-
CH2-COO-
Anion o charakterze słabo zasadowym /A-/
Podobnie jak poprzednio (w przypadku dodawania HCl) wytwarza się układ buforowy i pH miareczkowanego roztworu wolno się zmienia.
Po dodaniu zasady w ilości gramorównoważników odpowiadającej połowie obecnych w roztworze moli glicyny:
pH = pK2 = 9,6
W tym punkcie krzywa wykazuje przegięcie.
Podobnie jak aminokwasy, białka także mają charakter amfoteryczny. W cząsteczce białka grupami zdolnymi do jonizacji są grupy –COOH aminokwasów dwukarboksylowych, grupy aminowe –NH2 aminokwasów zasadowych, końcowe grupy karboksylowe i aminowe, grupa –OH tyrozyny, -SH cysteiny, reszta imidiazolowa histydyny, guanidynowa argininy oraz reszty fosforanowe fosfoproteidów. Zarówno dysocjacja grup karboksylowych jak i przyłączanie jonów wodorowych do grup aminowych białka zależy od pH roztworu.
Tak jak dla aminokwasów, również i dla białek istnieje pojęcie punktu izoelektrycznego. Ze względu na obecność w łańcuchach bocznych białek zjonizowanych grup funkcyjnych cząsteczki białka wykazują określony ładunek elektryczny. Ładunek ten zależy od rodzaju i liczby grup zdolnych do jonizacji, a także pH roztworu. W określonym pH, gdy cząsteczka zawiera jednakową liczbę grup dodatnich i ujemnych, białko będzie wykazywało sumaryczny ładunek zerowy. Ta wartość pH roztworu odpowiada punktowi izoelektrycznemu (pHi) białka.
Znajomość pHi ma duże znaczenie przy charakteryzowaniu białek oraz ich rozdzielaniu. W punkcie izoelektrycznym rozpuszczalność białek jest najmniejsza i najłatwiej można je wytrącić z roztworu. Poza tym w pHi białka wykazują najmniejszą lepkość i najsłabiej pęcznieją.
Część doświadczalna.
Odczynniki
1. 0,1 N wodny roztwór glicyny
2. 0,1 N roztwor NaOH i HCl
3. bufory wzorcowe o pH 3 i 9.
Sprzęt:
Pipety na 10 ml, 4 zlewki na 100 ml, biurety, papier milimetrowy, pH-metr, mieszadło magnetyczne.
Uwaga. Przed rozpoczęciem części doświadczalnej należy:
1. Dokładnie zapoznać się z częścią teoretyczną
2. Skonsultować się z prowadzącym asystentem w celu uzyskania niezbędnych informacji o wykonaniu pomiarów na pH-metrze
1. Miareczkowanie kwasem
Wykalibrować pH-metr używając buforu wzorcowego o pH=3. Następnie odmierzyć za pomocą cylindra 10 ml 0,1 M roztworu glicyny i 10 ml wody, zmieszać, zmierzyć pH roztworu glicyny przed rozpoczęciem miareczkowania. Dodawać z biurety najpierw po 0,5 ml 0,1 N HCl przy równoczesnym mieszaniu roztworu, każdorazowo mierząc pH. Przy dalszym miareczkowaniu dodawać 1 ml a później 2 ml 0,1N kwasu, ponieważ pod koniec miareczkowania pH zmienia się wolno. Zakończyć pomiar po dodaniu 15 ml 0,1 N HCl
2. Miareczkowanie zasadą.
Wykalibrować pH-metr używając buforu wzorcowego o pH =9. Odmierzyć do zlewki 10 ml 0,1 M roztworu glicyny i 10 ml wody. Zmieszać, zmierzyć pH i miareczkować 0,1 N NaOH tak jak w przypadku kwasu. Zakończyć miareczkowanie po użyciu 15 ml 0,1 N NaOH.
Wyniki obydwu miareczkowań umieścić w podanej tabeli, a następnie wykreślić krzywą miareczkowania zaznaczając na osi pionowej liczbę miligramorównoważników kwasu i zasady użytych do miareczkowania. Na osi poziomej zaznaczyć wartości pH.
Z wykreślonej krzywej miareczkowania wyznaczyć wartości pK1 i pK2 grup funkcyjnych uwzględniając, że do miareczkowania użyto 10 ml 0,1 M roztworu glicyny co odpowiada 1 miligramorównoważnikowi glicyny. W ten sposób pH = pK1 po dodaniu 0,5 miligramorównoważnika HCl (1ml 0,1 N HCl odpowiada 0,1 miligramorównoważnika HCl; 0,5 miligramorównoważnika - 5 ml 0,1 N HCl), a pK2 po dodaniu 0,5 miligramorównoważnika NaOH (5 ml 0,1 N NaOH – 0,5 miligramorównoważnika NaOH).
Tabela 1. Wyniki miareczkowań glicyny roztworami kwasu i zasady
Numer odczytu
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
...
gizia2592