moja część sprawka z pektyn.docx

2.3. Oznaczanie aktywności pektynoesterazy (ćwiczenie pokazowe):

Zasada oznaczenia:
Aktywność pektynoesterazy (PE) oznacza się na podstawie ilości grup karboksylowych uwolnionych w wyniku enzymatycznej hydrolizy wiązania estrowego w pektynie.
Różnica w objętościach 0,1 M NaOH, zużytych na odmiareczkowanie próby właściwej i ślepej, odpowiada ilości ługu potrzebnego do związania uwolnionych w czasie reakcji grup karboksylowych.

Równanie reakcji hydrolizy wiązania estrowego:
COOCH3H2OCOOH+CH3OH

Opis doświadczenia:
Przygotowanie próby właściwej:
Do zlewki o pojemności 200ml wlaliśmy 50ml roztworu pektyny w 0,1 M NaCl ogrzanej do temperatury 30°C. Przy pomocy 0,1 M NaOH (miareczkując nim) doprowadziliśmy pH pektyny do 4 czyli do optymalnego pH działania enzymu, a także aby określić ilość grup –COOH obecnych w pektynie przed zadziałaniem enzymu. Dodaliśmy 50 ml wodnego roztworu preparatu pektynolitycznego (2% rapidaza rozcieńczona 200-krotnie) podgrzanego do tej samej temperatury. Po wymieszaniu mieszaninę inkubowaliśmy na łaźni wodnej o temperaturze 30°C w czasie 30 minut. Następnie za pomocą 0,1 M roztworu NaOH doprowadziliśmy pH mieszaniny do 7,5 , notując zużycie ługu w celu zobojętnienia grup –COOH, które powstały pod wpływem działania enzymu.
Przygotowanie próby ślepej:
Do zlewki o pojemności 200ml wlaliśmy 50ml roztworu pektyny w 0,1M NaCl ogrzanej do temperatury 30°C. Miareczkując 0,1M NaOH doprowadziliśmy pH pektyny do 4 czyli do optymalnego pH działania enzymu, a także aby określić ilość grup –COOH obecnych w pektynie przed zadziałaniem enzymu. Dodaliśmy 50 ml wodnego roztworu preparatu pektynolitycznego (2% rapidaza rozcieńczona 200-krotnie) uprzednio zinaktywowanego przez ogrzewanie we wrzącej łaźni wodnej przez 25 minut. Po wymieszaniu mieszaninę inkubowaliśmy na łaźni wodnej o temperaturze 30°C w czasie 30 minut. Następnie za pomocą 0,1 M roztworu NaOH doprowadziliśmy pH mieszaniny do 7,5 , notując zużycie ługu w celu zobojętnienia grup –COOH, które powstały pod wpływem działania enzymu.

Obliczenia:
Wyniki miareczkowania:

·         V - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na miareczkowanie grup karboksylowych, uwalnianych w próbie właściwej:
V = V1+V2
gdzie:
V1 - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na doprowadzenie pH roztworu pektyny do pH=4, a także na zobojętnienie grup karboksylowych obecnych w pektynie przed zadziałaniem enzymu
(w próbie właściwej) [ml],
V1=11,2ml,
V2 - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na zobojętnienie grup karboksylowych powstałych w pektynie po zadziałaniu enzymu (w próbie właściwej) [ml],
V2=15,8ml.

V = V1+V2= 11,2 ml + 15,8 ml = 27 [ml]

·         V0 – ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na miareczkowanie grup karboksylowych uwalnianych w próbie ślepej:
V0 = V01+V02
gdzie:
V01 - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na doprowadzenie pH roztworu pektyny do pH=4, a także na zobojętnienie grup karboksylowych obecnych w pektynie przed zadziałaniem enzymu
(w próbie ślepej) [ml],
V01=10,6ml,
V02 - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na zobojętnienie grup karboksylowych powstałych w pektynie po zadziałaniu enzymu (w próbie ślepej) [ml],
V02=0,1ml.

V0 = V01+V02= 10,6 ml + 0,1 ml = 10,7 [ml]

Aktywność pektynoesterazy wyraża się jako ilość mikrorównoważników wiązań estrowych, zhydrolizowanych przez 1g (lub 1ml) preparatu pektynolitycznego, w czasie 1 minuty, w temperaturze 30°C, w obecności 0,1 M NaCl μmolwiązań estrowychmlroztworu∙min.

Do obliczeń aktywności pektynoesterazy stosujemy wzór:
U PE= V-V0∙100v ∙t
gdzie:
U (PE) – aktywność pektynoesterazy [μmolwiązań estrowychmin∙mlroztworu],
V - ilość ml 0,1 M NaOH, zużytych na miareczkowanie grup karboksylowych uwalnianych w próbie właściwej [ml],
V0 – ilość ml 0,1 M NaOH, zużytych na miareczkowanie grup karboksylowych uwalnianych w próbie ślepej [ml],
100 – ilość mikrorównoważników wiązań estrowych, odpowiadająca 1ml 0,1 M NaOH
[μmolwiązań estrowych1ml0,1M NaOH],
t – czas hydrolizy wiązań pektynowych w pektynie w temperaturze 30°C przez enzym [min],
v – ilość preparatu pektynolitycznego [ml], przy czym:
v=50ml200
gdzie:
50 – ilość preparatu pektynolitycznego użyta do oznaczenia [ml],
200 – wartość rozcieńczenia preparatu pektynolitycznego.
dla:
V = 11,2 ml + 15,8 ml = 27 [ml],
V0 = 10,6 ml + 0,1 ml = 10,7 [ml],
v= 50ml200=0,25 [ml],
t = 30 [min],

mamy:
U PE= V-V0∙100v ∙t=27-10,7ml∙100μmolwiązań estrowych1mlroztworu0,25ml∙30min=16,3∙1007,5μmolwiązań estrowychmlroztworu∙min=16307,5μmolwiązań estrowychmlroztworu∙min=217,33 μmolwiązań estrowychmlroztworu∙min

Wnioski:
Według powyższego wyniku wyliczonej aktywności pektynoesterazy (PE) w wodnym roztworze pektynolitycznym równego 217,33 [µmolwiązań estrowych/ml*min] wiemy, że w ciągu jednej minuty, w temperaturze 30°C, w obecności 0,1 M NaCl zostało zhydrolizowanych przez 1ml wodnego roztworu preparatu pektynolitycznego 217,33 mikrorównoważników wiązań estrowych w roztworze pektyny.