Nowy Dokument programu Microsoft Word.docx

Enzymy restrykcyjne

Enzymy izolowane z różnych szczepów bakterii mające zdolność do rozpoznawania
specyficznej sekwencji DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA
Nazewnictwo enzymów opiera się na literowych skrótach: pierwsza litera oznacza
rodzaj, a dwie następne gatunek bakterii z której pochodzi dany enzym; następna
litera oznacza szczep lub typ, a cyfra rzymska kolejne enzymy z danego szczepu lub typu
Np. EcoRI – pierwszy enzym z Escherischa coli szczep RY13
Większość enzymów rozpoznaje cztero- lub sześcionukleotydowe palindromowe sekwencje (posiadające oś symetrii)
Enzymy restrykcyjne mogą generować „tępe” lub „lepkie” końce

Np. HaeIII  5’ GGCC 3’                               5’ GG   CC 3’
                    3’ CCGG 5’                               3’ CC   GG 5’  „tępe” końce
EcoRI 5’ GAATTC 3’                           5’ G   AATTC 3’
                3’ CTTAAG 5’                           3’ CTTAA   G 5’  „lepkie” końce                

Miezzanina PCR

•           Matryca – DNA (1pg-1mg)

•           Bufor (Tris-HCl pH=8,3)

•           Substraty –dNTP (mieszanina dCTP, dTTP, dGTP, dATP)

•           Jony Mg2+ (w postaci chlorku magnezu – 1,5mmol/l)

•           Startery (20pmol każdego)

•           Termostabilna polimeraza DNA

•           H20

ZAST 1. Genetyka molekularna (sekwencjonowanie,  przygotowywanie znakowanych sond
molekularnych do przeszukiwania bibliotek genowych, do hybrydyzacji Southerna i northern,
klonowanie DNA, wydłużanie końca 5’ i 3’ badanej sekwencji, badania poziomu ekspresji genów)
2. Medycyna (poszukiwanie mutacji warunkujących choroby dziedziczne, ustalanie nosicielstwa,
diagnostyka prenatalna chorób genetycznych i infekcyjnych, genotypowanie zgodności tkankowej
między biorcą i dawcą przy przeszczepach, określanie płci, terapia genowa, badania nowotworów
polegające na identyfikacji mutacji w onkogenach i genach supresorowych)
3. Medycyna sądowa (identyfikacja ofiar, identyfikacja przestępców, ustalanie ojcostwa)
4. Detekcja GMO (organizmów modyfikowanych genetycznie)
5. Genetyka populacyjna (badanie zmienności genetycznej osobników
i całych populacji)
6. Antropologia, ewolucjonizm, paleobiologia, ekologia, demografia roślin i zwierząt

plazmidowe

• hodowla E. coli w pożywce LB

• wirowanie hodowli

• zawieszenie osadu bakterii w roztworze I (glukoza, EDTA, Tris-HCl)

• liza komórek bakteryjnych za pomocą roztworu II (NaOH, SDS)

• renaturacja (kwas octowy)

• usunięcie RNA (RNaza)

• usunięcie białek (fenol i chloroform)

• wytrącanie DNA (96% etanol)

• oczyszczanie DNA (70% etanol)

rozlin

• roslhomogenizacja tkanki w ciekłym azocie

• inkubacja w buforze z CTAB (bromek cetylotrimetyloaminowy) z NaCl

• usuwanie białek i lipidów (chloroform)

• wytrącanie DNA (izopropanol)

• oczyszczanie DNA (70% etanol)

bakteria

• inkubacja w buforze z SDS i proteinazą K

• inkubacja z CTAB i NaCl

• usuwanie białek (fenol i chloroform)

• wytrącanie DNA (izopropanol)

• oczyszczanie DNA (70% etanol)