Enzymy restrykcyjne
Enzymy izolowane z różnych szczepów bakterii mające zdolność do rozpoznawaniaspecyficznej sekwencji DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA Nazewnictwo enzymów opiera się na literowych skrótach: pierwsza litera oznacza rodzaj, a dwie następne gatunek bakterii z której pochodzi dany enzym; następna litera oznacza szczep lub typ, a cyfra rzymska kolejne enzymy z danego szczepu lub typuNp. EcoRI – pierwszy enzym z Escherischa coli szczep RY13 Większość enzymów rozpoznaje cztero- lub sześcionukleotydowe palindromowe sekwencje (posiadające oś symetrii) Enzymy restrykcyjne mogą generować „tępe” lub „lepkie” końce
Np. HaeIII 5’ GGCC 3’ 5’ GG CC 3’ 3’ CCGG 5’ 3’ CC GG 5’ „tępe” końceEcoRI 5’ GAATTC 3’ 5’ G AATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 3’ CTTAA G 5’ „lepkie” końce
Miezzanina PCR
• Matryca – DNA (1pg-1mg)
• Bufor (Tris-HCl pH=8,3)
• Substraty –dNTP (mieszanina dCTP, dTTP, dGTP, dATP)
• Jony Mg2+ (w postaci chlorku magnezu – 1,5mmol/l)
• Startery (20pmol każdego)
• Termostabilna polimeraza DNA
• H20
ZAST 1. Genetyka molekularna (sekwencjonowanie, przygotowywanie znakowanych sond molekularnych do przeszukiwania bibliotek genowych, do hybrydyzacji Southerna i northern, klonowanie DNA, wydłużanie końca 5’ i 3’ badanej sekwencji, badania poziomu ekspresji genów)2. Medycyna (poszukiwanie mutacji warunkujących choroby dziedziczne, ustalanie nosicielstwa, diagnostyka prenatalna chorób genetycznych i infekcyjnych, genotypowanie zgodności tkankowej między biorcą i dawcą przy przeszczepach, określanie płci, terapia genowa, badania nowotworów polegające na identyfikacji mutacji w onkogenach i genach supresorowych)3. Medycyna sądowa (identyfikacja ofiar, identyfikacja przestępców, ustalanie ojcostwa)4. Detekcja GMO (organizmów modyfikowanych genetycznie)5. Genetyka populacyjna (badanie zmienności genetycznej osobników i całych populacji)6. Antropologia, ewolucjonizm, paleobiologia, ekologia, demografia roślin i zwierząt
plazmidowe
rozlin
bakteria
Rainhardt