Wykład 3
Stężenie substratu
Normalny układ zależności szybkości działania enzymu od stężenia substratu ([S]) polega na tym, że przy małych stężeniach substratu podwojenie [S] powoduje podwojenie początkowej szybkości (Vo). Jednakże przy większych stężeniach substratu enzym ulega wysyceniu i dalszy wzrost [S] powoduje tylko małą zmianę wartości Vo. Dzieje się tak, ponieważ przy wysycających stężeniach substratu praktycznie wszystkie cząsteczki enzymu zawierają związany substrat. Sumaryczna szybkość działania enzymu jest teraz zależna od szybkości, z jaką produkt może oddysocjować z enzymu i dalsze dodanie substratu nie będzie już miało na to wpływu. Kształt wykresu przedstawiającego wartość Vo jako funkcję [S] jest nazywany krzywą hiperboliczną.
V0
[S]
Stężenie enzymu
Gdy stężenie substratu jest wysycające (tj. wszystkie cząsteczki enzymu mają związany substrat), podwojenie stężenia enzymu spowoduje podwojenie V0. Zależność ta ujawni się jako linia prosta na wykresie przedstawiającym Vo jako funkcję stężenia enzymu.
Temperatura
Temperatura wpływa na szybkość reakcji katalizowanych enzymatycznie w dwojaki sposób. Po pierwsze wzrost temperatury zwiększa energię termiczną cząstek substratu. To powoduje zwiększenie proporcji cząsteczek substratu mających dostateczną ilość energii, aby przekroczyć zmianę energii swobodnej (Gibbsa) aktywacji (DG++), przez to zwiększa szybkość reakcji. Równocześnie jednak w wyższych temperaturach ujawnia się drugi efekt; wzrastająca energia termiczna cząsteczek, które tworzą strukturę samego białka enzymatycznego, zwiększa szansę zerwania licznych słabych wiązań niekowalencyjnych (wiązania wodorowe, siły van der Vaalsa itd.) utrzymujących trójwymiarową strukturę enzymu. W końcowym efekcie będzie to prowadzić do denaturacji (rozfałdowania) enzymu, a nawet małe zmiany trójwymiarowego kształtu enzymu mogą zmienić strukturę miejsca aktywnego i doprowadzić do spadku aktywności katalitycznej. Ostateczny wpływ podwyższenia temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej jest wynikiem równowagi między tymi dwoma przeciwnymi działaniami. Dlatego też wykres zależności V0 od temperatury będzie miał kształt krzywej o wyraźnie zaznaczonym optimum termicznym. Dla wielu enzymów ssaków przypada ono na około 37°C, ale istnieją organizmy, których enzymy zaadaptowały się do działania w temperaturach zarówno znacznie wyższych jak i niższych. Np. polimeraza TaQ, której używa się do PCR-u występuje u bakterii żyjącej w gorących źródłach, a więc przystosowanej do optymalnej pracy w wysokich temperaturach.
Wartość pH
Każdy enzym ma optymalne pH działania, w którym szybkość katalizowanej przez niego reakcji jest maksymalna. Małe odchylenia pH od wartości optymalnej powodują spadek aktywności, wywołany zmianami jonizacji grup w aktywnym miejscu enzymu. Większe odchylenia pH prowadzą do denaturacji samego białka enzymatycznego w wyniku zakłucenia licznych słabych oddziaływań niekowalencyjnych, utrzymujących trójwymiarową strukturę białka. Wykres Vo jako funkcji pH daje zazwyczaj krzywą o kształcie dzwonu. Wiele enzymów wykazuje optimum aktywności w pobliżu pH 6,8, ale ogólnie istnieje duże zróżnicowanie optimum pH enzymów, wywołane różnicami środowiska, w którym enzymom przyszło działać. Na przykład enzym trawienny pepsyna jest przystosowany do działania w kwaśnym pH żołądka ( pH ok. 2,0)
Vo Vo enzym 2
Enzym 1
4 37 50 4 5 6 7 8
Temperatura (°C) pH
Wpływ temperatury oraz pH na aktywność enzymu.
Izoenzymy
Izoenzymy ( izozymy) są różnymi formami enzymu, które katalizują tę samą reakcję, ale wykazuja odmienne właściwości fizyczne lub kinetyczne, takie jak punkt izoelektryczny, optimum pH, powinowactwo do substratu lub wrażliwość na inhibitory. Różne formy izozymów danego enzymu pochodzą zazwyczaj z różnych genów i często występują w różnych tkankach ciała. Przykładem enzymu, który ma różne formy izozymowe, jest dehydrogenaza mleczanowa (LDH), katalizująca odwracalne przekształcenie pirogronianu w mleczan w obecności NADH jako koenzymu. LDH jest tetramerem dwóch różnych typów podjednostek określanych jako H oraz M, które wykazują małe różnice w sekwencji aminokwasów. Podjednostki mogą się ze sobą łączyć kombinatorycznie, tworząc pięć izoenzymów o składzie H4, H3M, H2M2, HM3 i M4. Te pięć izoenzymów można rozdzielić elektroforetycznie. Podjednostka M dominuje w mięśniach szkieletowych i wątrobie, natomiast podjednostka H dominuje w sercu. Izoenzymy H4 oraz H3M występują głównie w nerkach natomiast HM3 i M4 występują w wątrobie i mięśniach szkieletowych. Tak więc wzór izoenzymów jest charakterystyczny dla danej tkanki, co ma ogromne znaczenie diagnostyczne w medycynie. Zawał mięśnia sercowego, żółtaczka zakaźna i choroby mięśni powodują w uszkodzonej tkance śmierć komórek, których zawartość przedostaje się do krwi. Ponieważ LDH jest rozpuszczalnym białkiem cytozolowym, łatwo zostaje w tych warunkach uwolniona do krwi, która normalnie zawiera mało LDH. Dlatego też wzór izoenzymów LDH we krwi wskazuje, z której tkanki izoenzymy pochodzą, i można go użyć do postawienia diagnozy.
Kinetyka i inhibicja enzymów
Model Michealisa-Menten opiera się na następującej koncepcji katalizy enzymatycznej
E+S«ES«E+P
Enzym (E) wiąże się ze swym substratem (S) tworząc kompleks enzym-substrat (ES). Kompleks ES może dysocjować z powrotem do E + S lub przekształcać się w sam E i produkt P. Stałe szybkości K1, K2, K3 opisują szybkości przebiegu każdego etapu procesu katalitycznego. Przyjmuje się, iż reakcja odwrotna w której enzym i produkt (E+P) były by przekształcone w kompleks ES, przebiega z tak małą szybkością, że reakcję tę można pominąć. Na podstawie obserwacji właściwości enzymów wiadomo było, że przy małych stężeniach substratu początkowa szybkość reakcji Vo jest wprost proporcjonalna do stężenia substratu [S]. Przy dużych stężeniach [S] szybkość zmierza do wartości max. Tzn. że szybkość staje się niezależna od [S]. Rys 1a. Szybkość max. Oznacza się jako Vmax (mmolxmin-1). W celu opisania tych obserwacji. Michaelis Menten (MM) wprowadzili równanie nazwane od ich nazwisk równaniem MM.
Vo=(Vmax x [S]) / (Km +[S])
Równanie to opisuje krzywą hiperboliczną typu pokazanego dla danych doświadczalnych z rysunku 2. wprowadzając to równanie MM zdefiniowali nową stałą Km zwaną stałą Michaelisa (molalność, M);
Km=(k2+k3)/k1
Km jest miarą stabilności kompleksu ES stanowiąc iloraz sumy szybkości rozkładu ES i szybkości jego powstawania. Dla wielu enzymów k2 jest znacznie większa niż k3. w tych warunkach wartość Km staje się miarą powinowactwa enzymu do substratu, ponieważ wartość ta zależy od względnych wartości k1 i k2 dla, odpowiednio, tworzenia i dysocjacji kompleksu ES. Duża wartość Km wskazuje na silne wiązanie substratu ( k2 przeważa nad k1), a mała wartość Km wskazuje na silne wiązanie substratu ( k1 przeważa nad k2). Wartość Km można wyznaczyć doświadczalnie na podstawie tego, że wartość ta równa się stężeniu substratu, przy którym szybkość reakcji jest równa połowie Vmax.
Wykres Lineweavera – Burka
Ponieważ Vmax jest osiągana przy nieskończenie dużym stężeniu substratu nie można precyzyjnie wyznaczyć wartości Vmax ( a więc również wartości Km). Z wykresu hiperbolicznego przedstawionego na rysunku 4a. (1b – wykład). Jednakże wartości Vmax i Km można wyznaczyć doświadczalnie mierząc Vo przy różnych stężeniach substratu (rys2). Następnie wykonuje się wykres kinetyki enzymu w układzie współrzędnych, które są odwrotnościami V i [S], czyli wykres L-B, przedstawiając 1/Vo jako funkcję 1/[S] rys 1b. Wykres taki pochodzi z przekształcenia równania MM do postaci:
1/Vo=(1/Vmax)+(Km/Vmax) x (1/[S]), dającej linię prostą, której przecięcie z osią y równa się 1/ Vmax, a przecięcie z osią x równa się –1/Km. Nachylenie linii ma wartość Km/ Vmax rys 1b. Wykres L-B stanowi również użyteczną metodę określania typu wiązania się inhibitora z enzymem. Wprawdzie dla wielu enzymów model L-M stanowi bardzo dobry model danych doświadczalnych , ale istnieją enzymy, które nie podlegają kinetyce MM. Enzymy te, to np. transkarbamoilaza asparaginianowa (ATCaza), są nazywane enzymami allosterycznymi.
gandziaa92