Sterole są to organiczne związki chemiczne, alkohole należące do steroidów. Istnieje podział w zależności do jakiej grupy organizmów należą. My zajmowaliśmy się fitosterolami czyli sterolami pochodzenia roślinnego, a dokładniej sterolami wolnymi, estrami steroli, glukozydami steroli i acyloglukozydami steroli.
Ćwiczenia rozpoczęły się od ekstrakcji steroli ze świeżych shomogenizowanych liści. Do ekstrakcji używaliśmy najpierw metanolu a następnie mieszaniny metanol chloroform. Różna polarność tych związków pozwoliła nam najpierw pozbyć się wody która jest polarna, następnie roztwór o niskiej polarności pozwolił nam wyekstrahować poszukiwane przez nas związki, jednak zanieczyszczone. Przesącz zagęściliśmy na wyparce obrotowej aby pozbyć się niepotrzebnego rozpuszczalnika. Następnie zagęszczony przesącz rozpuściliśmy w mieszaninie butanol woda i przepłukiwaliśmy wodą nasyconą butanolem. Pozwoliła nam to pozbyć się nielipidowych związków polarnych. Następnie fazę butanolową ponownie zatężyliśmy do sucha.
Wydajność na tym etapie wyniosła ok. 265mg.
Kolejną czynnością była chromatografia kolumnowa. Na odpowiednio przygotowaną kolumnę nałożyliśmy nasz preparat rozpuszczony w mieszaninie chloroform metanol. Pierwsza frakcja była eluowana mieszaniną chloroform metanol 99:1 czyli o takiej samej sile jonowej co rozpuszczalnik. Pozwala nam to na otrzymanie w eluacie w większości wolnych steroli oraz estrów steroli. Druga frakcja byłe eluowana mieszaniną chloroform metanol 8:2 czyli została zmieniona siła jonowe eluatu. Pozwoliło to na wyeluowanie estrów steroli oraz glukozydów steroli. Eluaty zostały zatężone do sucha.
Wydajność na tym etapie wyniosła odpowiednio
Frakcja I 109mg
Frakcja II 131mg
Następnie przeprowadziliśmy hydrolizę zasadową (rozpadwiązania estrowego) w wypadku frakcji pierwszej oraz kwasową (rozpad wiązań glikozydowych) w wypadku frakcji drugiej. Hydroliza zasadowa przebiegała w mieszaninie wodorotlenek sodu i metanol w temperaturze 80 stopni. Następnie próbke ekstrahowaliśmy eterem etylowym i odpłukaliśmy wodą do pH 7.
Hydroliza kwasowa przebiegała w mieszaninie kwas solny metanol w temperaturze 80 stopni. Następnie frakcję drugą tak jak pierwszą ekstrahowaliśmy eterem etylowym i odpłukaliśmy wodą do pH 7. Różne hydrolizy wynikają z tego, że poszukiwane związki mają różne ugrupowania boczne.
Po zatężeni do sucha obu frakcji w celu pozbycia się eteru, rozpuściliśmy je w chloroformie i nanieśliśmy na płytkę z żelem krzemionkowym. Którą rozwijaliśmy w układzie chloroform: metanol 95:5. Gdy wysuszyliśmy płytkę wywołaliśmy ją rodaminą co pozwoliło nam na uwidocznienie steroli pod lampą UV. Następnie zeskrobane sterole wyeluowaliśmy eterem etylowym i odparowaliśmy rozpuszczalnik.
Otrzymane preparaty użyliśmy do oznaczenia steroli metodą Liebermanna-Burtharda oraz w chromatografi gazowej.
Wyniki z chromatografi gazowej:
Zawartość steroli w badanej próbie w ug:
Frakcja I
Cholesterol - 20,2
Kampesterol -53,6
Stigmasterol – 450
Fitosterol – 980,6
Frakcja II
Cholesterol – 2,4
Kampesterol -5,8
Stigmasterol – 33,2
Fitosterol – 120
Wyniki zgadzają się założeniami, czyli skład obu frakcji powinien być jednakowy, jednak frakcja pierwsza powinna zawierać większą ilość steroli. W naszym wypadku zgadza się to, jednak druga frakcja zawiera za mało steroli.
Oznaczanie metodą Liebermanna-Burtharda
Krzywa kalibracyjna zawartość cholesterolu [mg]
3-0,325 3’-0,35 0,3375 1
4-0,236 4’-0,24 0,238 0,75
5-0,142 5’-0,15 0,146 0,5
6-0,116 6’-0,126 0,121 0,4
7-0,076 7’-0,07 0,073 0,25
Wyniki Zawartość mg/g św. masy
Frakcja I 0,082 i 0,073 0,0775 0,26 0,026
Frakcja II 0,015 i 0,016 0,0155 0,1 0,01
carambola